Western Blot原理及流程（2）-海南省热带心血管病研究重点实验室-海南医科大学

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日期：2021-02-17 点击数：

配胶

1、制胶：浓缩胶/上层（5%）；分离胶/下层（根据蛋白分子大小而定）

（1）制胶前用纯水检漏，加入纯水放置2-3min；

（2）配制下层胶：试剂盒配置好的胶液靠边注入玻璃板（尽量不要产生气泡）；加入无水乙醇/双蒸水压平胶面，静置等胶凝固（根据天气室温变化，一般30min以上）；配制上层胶：下层胶凝固后倒掉无水乙醇/双蒸水，滤纸吸干，上层胶缓缓注入，插梳子，等待凝固（约1h）

分离胶范围：

电泳

1、配制上样体系：蛋白溶液+5×loading buffer+PBS

蛋白上样量：20-50ug

2、上样：最左和最右孔可加SDS-PAGE loading buffer压平条带；可与最中央或左右两端各加入3-5ul的蛋白maker；蛋白样品上样（9ul）

3、将胶置于电泳槽中，倒入电泳缓冲液，内部要漫过矮板，外部要漫过玻璃板底部；

4、准备样品 maker 于冰盒上，顺序排好，上样，并在实验本上记录好；

5、盖上电源盖，正负极相互对应，接通电源，恒压浓缩胶80V，30min或maker分离后可更改电压为120v，跑分离胶。待 loading buffer中的溴酚蓝跑至脚底部 1cm 处停止电泳。整个时间大概为 1.5h-2h。